Главная Обратная связь

Дисциплины:






Методи виділення чистих культур, засновані на механічному принципі



Метод фракційних (послідовних) розведень, запропонований Л.Пастером, був одним із найперших, який застосовувався для механічного роз’єднання мікроорганізмів. Він полягає в проведенні послідовних серійних розведень матеріалу, який містить мікроби, в стерильному рідкому живильному середовищі. Цей прийом достатньо кропіткий і недосконалий у роботі, оскільки не дозволяє контролювати кількість мікробних клітин, які попадають у пробірки при розведеннях.

Цього недоліку не має метод Коха (метод пластинчастих розведень). Р.Кох використовував щільні живильні середовища на основі желатину або агар-агару. Матеріал з асоціаціями різних видів бактерій розводився у декількох пробірках з розтопленим і дещо охолодженим желатином, вміст яких пізніше виливався на стерильні скляні пластини. Після застигання середовища воно культивувалось при оптимальній температурі. У його товщі утворювались ізольовані колонії мікроорганізмів, які легко можуть бути перенесені на свіже живильне середовище за допомогою платинової петлі для одержання чистої культури бактерій.

Метод поверхневих розсівів Дригальського є більш досконалим методом, який широко розповсюджений в повсякденній мікробіологічній практиці. Спочатку на поверхню сере­довища в чашці Петрі піпеткою або петлею наносять досліджуваний матеріал. За допомогою металевого або скляного шпателя його ретельно втирають у середовище. Чашку під час посіву тримають привідкритою і обережно обертають, щоб рівномірно розподілити матеріал. Не стерилізуючи шпателя, проводять ним посів матеріалу в іншій чашці Петрі, при потребі – в третій. Тільки після цього шпатель занурюють у дезінфікуючий розчин або прожарюють у полум’ї пальника. На по­верх­ні середовища в першій чашці спостерігаємо, як правило, суцільний ріст бакте­рій, у другій – густий ріст, а в третій – ріст у вигляді ізольованих колоній.

 

Рис. 4 Колонії за методом Дригальського

 

Метод штрихових посівів сьогодні використовується в мікробіологічних лабораторіях найчастіше. Матеріал, який містить мікроорганізми, набирають бактеріологічною петлею і наносять на поверхню живильного середовища біля краю чашки. Знімають надлишок матеріалу і проводять посів його паралельними штрихами від краю до краю чашки. Через добу інкубації посівів при оптимальній температурі на поверхні чашки виростають ізольовані колонії мікробів.

Рис. 5 Метод поверхневих штрихів

 

Для одержання ізольованих колоній можна використати посів тампоном, яким проводили забір досліджуваного матеріалу. Дещо привідкривають чашку Петрі із живильним середовищем, вносять туди тампон і обережними рухами втирають матеріал у поверхню чашки, повертаючи поступово тампон і чашку.



Таким чином, істотна перевага методів пластинчастих розведень Коха, Дригальського і штрихових посівів полягає в тому, що вони створюють ізольовані колонії мікроорганізмів, які при інокуляції на інше живильне середовище перетворюються в чисту культуру

 

Біологічний принцип роз’єднання бактерій передбачає цілеспрямований пошук методів, які враховують численні особливості мікробних клітин. Серед найпоширеніших методів можна виділити наступні: - тип дихання (метод Фортнера); б - рухливiсть (метод Шукевича); в - кислотостiйкiсть; г - спороутворення; д - температурний оптимум; е - вибiркову чутливiсть лабораторних тварин до бактерiй.

Виділення чистої культури аеробних мікроорганізмів складається з ряду етапів.

У перший день (І етап дослідження) у стерильний посуд (пробірка, колба, флакон) забирають патологічний матеріал. Його вивчають за зовнішнім виглядом, консистенцією, кольором, запахом та іншим ознаками, готують мазок, фарбують і досліджують під мікроскопом. У деяких випадках (гостра гонорея, чума) на цьому етапі можна поставити попередній діагноз, а крім того, підібрати середовища, на які засіватиметься матеріал. Посів проводять бактеріологічною петлею (застосовується найчастіше), за допомогою шпателя за методом Дригальського, ватно-марлевим тампоном. Чашки закривають, перевертають догори дном, підписують спеціальним олівцем і ставлять у термостат при оптимальній температурі (37 °С) на 18-48 год. Мета етапу – одержати ізольовані колонії мікроорганізмів.

Однак, деколи з метою нагромадження матеріалу його засівають на рідкі живильні середовища.

На другий день (ІІ етап дослідження) на поверхні щільного живильного середовища мікроорганізми утворюють суцільний, густий ріст або ізольовані колонії. Колонія – це видимі неозброєним оком скупчення бактерій на поверхні або в товщі живильного середовища. Як правило, кожна колонія формується з нащадків однієї мікробної клітини (клон), тому їх склад досить однорідний. Особливості росту бактерій на живильних середовищах є проявом їх культуральних властивостей.

Чашки ретельно розглядають і вивчають ізольовані колонії, що виросли на поверхні агару. Звертають увагу на величину, форму, колір, характер країв і поверхні колоній, їх консистенцію та інші ознаки. При потребі досліджують колонії під лупою, малим чи великим збільшенням мікроскопа. Структуру колоній дослі­джують у прохідному світлі при малому збільшенні мікроскопа. Вони можуть бути гіалінові, зернисті, ниткоподібні чи волокнисті, які характеризуються наявністю переплетених ниток у товщі колоній.

Характеристика колоній – важлива складова частина роботи бактеріолога і лаборанта, адже мікроорганізмам кожного виду притаманні свої особливі колонії.

На третій день (ІІІ етап дослідження) вивчають характер росту чистої культури мікроорганізмів і проводять її ідентифікацію.

Спочатку звертають увагу на особливості росту мікроорганізмів на середовищі та роблять мазок, фарбуючи його за методом Грама, з метою перевірки культури на чистоту. Якщо під мікроскопом спостерігають бактерії однотипної морфології, розмірів та тинкторіальних (здатність фарбуватись) властивостей, роблять висновок, що культура чиста. У деяких випадках вже за зовнішнім виглядом та особливостями їх росту можна зробити висновок про вид виділених збудників. Визначення виду бактерій за їх морфологічними ознаками називається морфологічною ідентифікацією. Визначення виду збудників за їх культуральними ознаками називають культуральною ідентифікацією.

Однак цих досліджень недостатньо, щоб зробити остаточний висновок про вид виділених мікробів. Тому вивчають біохімічні властивості бактерій. Вони досить різноманітні.

Найчастіше досліджують цукролітичні, протеолітичні, пептолі­тичні, гемолітичні властивості, утворення ферментів декарбоксилаз, оксидази, каталази, плазмокоагулази, ДНК-ази, фібринолізину, перетворення нітратів у нітрити тощо. Для цього існують спеціальні живильні середовища, які засівають мікроорганізмами (строкатий ряд Гісса, МПБ, згорнута сироватка, молоко та ін.). Визначення виду збудника за його біохімічними властивостями називається біохімічною ідентифікацією.

Серед біохімічних властивостей культури особливо важливе значення має визначення її ферментативних властивостей.

Ц у к р о л і т и ч н і в л а с т и в о с т і б а к т е р і й виявляють при посіві їх на диференційно–діагностичні середовища з різними вуглеводами й індикатором (середовища Гісса). Такі середовища виготовляють шляхом додавання до пептонної води певного цукру і найчастіше індикатора Андреде, але можна використовувати бромтимолблау, лакмус тощо. Набір середовищ із різними вуглеводами (глюкоза, лактоза, мальтоза, маніт, сахароза, дульцит, арабіноза, сорбіт тощо), стерильним знежиреним молоком, молоко з лакмусом, молоко з метиленовою синькою називають ,,кольоровим рядом”.

Посіви культур здійснюють за загальноприйнятою методикою бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою. Після інкубації у термостаті враховують результат ферментації вуглеводів: зміна кольору поживного середовища (при індикаторі Андреде – червоний колір) означає розщеплення цукру й утворення у середовищі кислих продуктів розпаду. Якщо при розщеплені даного вуглеводу, поряд із кислотою, утворюється газ, то він вловлюється маленькими пробірками, які називають ,,поплавками” або ,,газівками” (їх вносять у пробірки одночасно з живильним середовищем). Для визначення цукролітичних властивостей часто використовують напіврідкі середовища, що містять вуглеводи та індикатор ВР (суміш водного голубого з розоловою кислотою), а також щільні середовища з вуглеводами й індикатором (наприклад, агар Ендо, агар Левіна, Плоскірєва).

П р о т е о л і т и ч н і в л а с т и в о с т і б а к т е р і йвиявляють посівом чистої культури мікробів у МПЖ (уколом), згорнуту сироватку крові або мозкове середовище. Пробірки з МПЖ інкубують при 18 – 20 ºС, сироватку і мозкове середовище при 37 ºС 24–48 год. Результати оцінюють за розрідженням желатини і характером росту по уколу; при посіві на згорнуту сироватку крові – за її розрідженням і утворенням навколо колонії заглиблення; при посіві на мозкове середовище – за здатністю анаеробів викликати його почорніння.

П р о т е о л і з к а з е ї н увизначають на молочному агарі Ейкмана (до 10 мл стерильного МПА, розплавленого на водяній бані, додають 3 мл знежиреного стерильного молока, змішують і розливають у чашки Петрі). Протеоліз проявляється пептонізацією казеїну: навколо колоній утворюється чітка прозора зона, просвітлення молочного агару. При посіві у рідке молоко протеоліз також виражається просвітленням стовпчика молока, водянистим вмістом і слизистим осадом.

Ступінь протеолізу і глибину розщеплення білка у різних видів бактерій визначають за утворенням ними кінцевих продуктів розпаду (індолу, сірководню, аміаку).

Індол визначають шляхом внесення під корок пробірки із засіяними на МПБ або бульйон Хоттінгера бактеріями фільтрувального висушеного папірця, обробленого гарячим насиченим розчином щавелевої кислоти. При наявності індолоутворення нижня частина індикаторного папірця зафарбується у рожевий колір .

Сірководень визначають шляхом внесення індикаторного папірця, обробленого 10% розчином оцтовокислого свинцю, який при позитивній реакції чорніє.

Аміак визначають шляхом внесення під корок пробірки з посівами лакмусового папірця, який при наявності аміакоутворення синіє.

Р е д у к ц і й н і в л а с т и в о с т івизначають на основі змін кольору органічної фарби (метиленова синька, малахітовий зелений, нейтральрот тощо), внесеної у живильне середовище (найчастіше у молоко). Під дією мікробних ферментів барвник відновлюється – знебарвлюється або змінює свій попередній колір. Внаслідок значного доступу кисню фарба може знову окислюватися і набувати попереднього кольору.

В и з н а ч е н н я к а т а л а з и. Деякі види мікроорганізмів у процесі дихання утворюють перекис водню, який за участі ферменту каталази розпадається на воду і молекулярний кисень, тому кількість її у культурі не досягає високих концентрацій. Для визначення каталази на поверхню однодобової агарової культури наносять 1 мл 1% розчину перекису водню так, щоб поверхня культури була повністю накрита тонким шаром. За наявності каталази спостерігається виділення бульбашок кисню.

Л і п о л і т и ч н і в л а с т и в о с т і (розкладання жиру) визначають посівом на середовища з вазеліновою олією.

В и з н а ч е н н я г е м о л і т и ч н и х в л а с т и в о с т е й. Окремі види бактерій у процесі своєї життєдіяльності продукують особливі речовини білкової природи - гемотоксини, які мають лізуючу дію на еритроцити. Для визначення гемолітичної здатності проводять посіви на живильні середовища, що містять 5% дефібринованої крові. Найчастіше використовують кров’яний МПА. Ріст на кров’яному середовищі мікроорганізмів із гемолітичними властивостями проявляється утворенням навколо колоній прозорої зони гемолізу (безколірної або зафарбованої) внаслідок лізису еритроцитів. У рідких живильних середовищах внаслідок гемолізу середовище стає прозорим (червона лакова кров).

Питання для самоконтролю

1. Що розумієте під терміном “посів, пересів, чиста культура, штам, клон, колонія” мікроорганізмів?

2. Які знаєте методи посівів?

3. Які знаєте методи виділення чистої культури?

4. Поясніть етапи виділення чистих культур.

5. На що звертають при характеристиці колоній?

6. Охарактеризуйте біохімічні властивості культур.

7. На яких середовищах визначають цукролітичні властивості мікроорганізмів?

 

 





sdamzavas.net - 2019 год. Все права принадлежат их авторам! В случае нарушение авторского права, обращайтесь по форме обратной связи...