Главная Обратная связь

Дисциплины:






Мутагенез за Кункелем



Для бактеріальної плазміди (позахромосомноїкільцьової ДНК) отримують уридинову матрицю, тобто таку саму молекулу, в якій залишки тиміну замінені на урацил. Праймер утворюють на матриці, проводять його добудову invitro за допомогою полімерази до кільцьової ДНК, які комплементарна уридиновій матриці. Трансформують двохланцюгову гібридну ДНК бактеріальної клітини, всередині якої уридинова матриця руйнується як чужорідна та на мутантній одноланцюговійкільцьовій ДНК добудовують другий ланцюг. Ефективність такого способу мутагенезу становить менше 100%.

3.4. Мутагенез за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

ПЦР дозволяє здійснювати сайт-спрямований мутагенез з використанням пари праймерів, які несуть матрицю, а також випадковий мутагенез. В останньому випадку помилки у послідовність ДНК вносяться полімеразою в умовах, які знижують її специфічність.

 

4. Значенняштучного мутагенезу в селекції рослин

Один з найважливіших прийомів експериментальної генетики. Мутагенез широко використовується для вивчення білків і поліпшення їх властивостей (спрямованої еволюції). У селекції мутагенез використовують для отримання перспективних мутантів тварин, рослин і мікроорганізмів. Мутагенез, як інструмент мінливості, вважається одним із рушійних чинників еволюції.

Штучний мутагенез, тобто створений людиною процес виникнення мутацій, успішно застосовується в селекції рослин.

Завдяки використанню мутагенів виникають мутантні форми рослин, у яких збережені цінні властивості форми або сорти і разом з тим поліпшені ознаки, особливо цікавлять селекціонерів.

Мутантна рослина лише в рідкісних випадках може бути відразу родоначальником сорту. У більшості випадків такі рослини служать тим матеріалом, який може бути використаний для створення сортів шляхом гібридизації та відбору. Таким чином, штучний мутагенез є важливим і ефективним в арсеналі методів, що використовуються в сучасній селекції.

Серед хімічних супермутагенівінвітро використовують два класи речовин: клас НАК (нітрозоалкілсечовин) і ДАК (діазокетонів).

Найбільш поширені супермутагени:

-етилметансульфонат (ЕМС);

-диметилсульфонат (ДМС);

-метилметансульфонат (ММС);

-етиленмін (ЕМ) та ін.

 

Розчини мутагенів готують, як правило, на середовищі для культивування і додають до суспензії клітин. Через певний час клітини промивають середовищем від мутагенів і ресуспензують у свіжому середовищі. Після 4-7 днів інкубаційного росту клітини знову промивають і ресуспензують до необхідної щільності. Спектр дії хімічних супермутагенів дуже широкий – від генних мутацій до різноманітних хромосомних перебудов.



 

Поряд з хімічними мутагенами в експерементах з культурами клітин широко використовують іонізуюче (рентгенівське, гама-промені) і ультрафіолетове випромінювання. Найбільш широкий спектр мутацій спостерігається при використанні іонізуючого випромінювання. При рентгенівському опроміненні клітин вченими одержані пігментдефектні лінії дурману і петунії, хлорстійкі лінії тютюну.

4.1. Об’єкти мутагенезу

Об’єктом для мутагенезу і селекції можуть бути калусні, суспензійні культури або ізольовані протопласти. Вибір об’єкту залежить від наявності розробленої технології стосовно до конкретної культури, а також від кінцевої мети дослідження.

Калусна тканина – доступний матеріал, який відносно легко одержують у лабораторних умовах. Використовують свіжовиділенукалусну тканину, що не втратила регенераційної здатності (тема: «регенерація рослин шляхом соматичного ембріоїдогенезу»). Відбір мутантів за допомогою калусних тканин часто використовують при селекції ліній, (стійких до фітозахворювань) і стресових факторів (Левенко Б.О., 1991).

Клітинна суспензія – це поодинокі клітини або клітинні агрегати, які вирощують на рідкому поживному середовищі в умовах постійної аерації. Аерація об’єктів забезпечується такими способами:

Культурою клітин, які занурені у рідке поживне на качалках ротаційного або шейкерного типу (накопичувальне культивування);

Вирощуванням шматків калусуна містках-підтримках з фільтрувального паперу.

Основні етапи одержання мутантних форм шляхом селекції на клітинному рівні:

1. Відбір об’єкту для мутагенезу – калусні, суспензійні культури, ізольовані протопласти;

2. Обробка об’єкту мутагеном (фізичні фактори – температура, опромінювання, хімічні речовини та ін.;

3. Інкубація клітин на рідкому поживному середовищі у неселективних умовах;

4. Перенесення суспензії у селектиивні умови (засолення, токсини, гербіциди, понижені або високі температури, метали та ін.);

5. Виділення життєздатних колоній, які вижили в жорстких селективних умовах;

6. Відбір змінених, стійких до селективного фактора клонів;

7. Індукція органогенезу або ембріоїдогенезу;

8. Одержання змінених рослин-регенерантів, які відрізняються в порівняні з материнськими рослинами;

9. Висадка рослин у ґрунт, вивчення генетичної природи стійкості, тестування на стійкість.

Загальна методологія відбору мутантів інвітро складається з таких етапів:

1. Селекція необхідних фенотипових варіантів на клітинному рівні.

2. Регенерація з клітин рослин.

3. Експресія мутаційних змін на рівні цілих рослин-регенерантів.

 

Створення імунних сортів - одне з головних завдань селекції, і в її успішному вирішенні велику роль повинні зіграти методи радіаційного і хімічного мутагенезу. З допомогою іонізуючих випромінювань і хімічних мутагенів можна ліквідувати окремі недоліки у сортів сільськогосподарських культур і створювати форми з господарсько корисними ознаками: не вилягають, морозостійкі, холодостійкі, скороспілі, з підвищеним вмістом білка та клейковини.

Можливі два основних шляхи селекційного застосування штучних мутацій: пряме використання мутацій, отриманих у самих кращих районованих сортів, і в процесі гібридизації.

У першому випадку ставиться завдання поліпшення існуючих сортів за деякими господарсько-біологічними ознаками, виправлення в них окремих недоліків. Цей метод вважається перспективним в селекції на стійкість до захворювань. Передбачається, що у будь-якого цінного сорту можна швидко отримати мутації стійкості і зберегти при цьому недоторканими інші господарсько-біологічні ознаки. Це дало б можливість селекціонерам швидко реагувати на утворення паразитів. Метод прямого використання мутацій розрахований на швидке створення вихідного матеріалу з потрібними ознаками і властивостями. Однак пряме і швидке використання мутацій при тих високих вимог, які пред'являються до сучасних селекційних сортів, далеко не завжди дає позитивні результати. Отриманий внаслідок мутагенезу вихідний матеріал повинен, як правило, пройти через гібридизацію. Це другий шлях використання штучних мутацій. У Краснодарському НДІСГ мутантний сорт ячменю Темп був включений в гібридизацію з контрастним по ряду ознак сортом західноєвропейської селекції. Це зумовило величезну генетичне різноманіття форм і поява трансгресивних ліній. З цих комбінацій було виділено сорт ярого ячменю Каскад, що перевершує вихідні форми по урожаю і багатьма іншими ознаками.

Мутації можуть змінювати своє фенотипне вираження в залежності від того, в який генотип вони включаються. Особливо це відноситься до малих фізіологічним мутацій. Тому схрещування якісно змінює вплив окремих мутацій на розвиток багатьох ознак і властивостей.

Широко застосовуються також поєднання індукованого мутагенезу з гібридизацією, обробка гібридного насіння мутагенами F0, F1 і старших поколінь, схрещування мутантних форм між собою і з кращими місцевими сортами, бек расова гібридизація.

Використовується експериментальний мутагенез і спільно з віддаленою гібридизацією. Шляхом штучних мутацій у ряді випадків вдається долати несхрещуваність різних далеких видів рослин, а також проводити пересадку шляхом транслокації окремих локусів хромосом диких видів у хромосомний комплекс культурних рослин.

Так, Е. Сирсу (США) вдалося перенести від егилопса в геном пшениці дуже невеликий шматочок хромосоми, контролюючий стійкість до іржі. В результаті була отримана нормально плодовита форма, нічим не відрізняється від пшениці, але володіє завдяки проведеній транслокації стійкістю до іржі. Аналогічним шляхом Ф. Елліот переніс пирію в геном пшениці локуси стійкості до стеблової іржі. Винятковий інтерес представляє експеримент Р. Штуббе (НДР) по поліпшенню дикого дрібноплідного помідора в процесі мутагенезу. Шляхом багаторазового п'ятиступінчастого опромінення променями рентгена і відбору він довів крупність плодів у цієї форми до нормальних розмірів. Поруч дослідників встановлено, що мутаційність віддалених гібридів значно вище, ніж внутрішньовидових і лінійних звичайних сортів.

Численні досліди показали, що частота і характер виникаючих мутацій в рівній мірі залежать як від виду мутагенів, так і від спадковості вихідного сорту. Вибір вихідного сорту для одержання мутацій так само важливий, як підбір батьківських пар при гібридизації. Для створення потрібних мутацій необхідно враховувати здатність сортів до утворення тих чи інших мутацій, а також частоту їх виникнення.

Виявлено, що чим ближче сорти за своїм походженням і генотипом, тим вони більше схожі на частоту і характер виникаючих мутацій, і, навпаки, чим генетично сорти менш споріднені, тим більше вони розрізняються за мутаційної мінливості. Таким чином, закономірності штучного мутагенезу у різних сортів підкоряються закону гомологічних рядів у спадковій мінливості.

Для одержання господарсько-цінних мутацій найбільш широко застосовуються гамма-промені, промені рентгена і нейтрони, а з хімічних мутагенів - алкілуючі з'єднання: етиленимін, нітрозоетилмочевина, етилметансульфонат та ін. Концентрація хімічних мутагенів та дози іонізуючих випромінювань не повинні бути дуже високими. Для опромінення насіння гамма-промені і промені рентгена застосовують в дозах від 5 до 10 кР; опромінення швидкими нейтронами проводять при дозах від 100 до 1000 рад. Якщо опроміненню піддається пилок, дозу зменшують у 1,5-2 рази. Хімічні мутагени зазвичай використовують у вигляді водних розчинів 0,05-0,2 %-ний концентрації при тривалості намочування насіння від 12 до 24 год. При цьому забезпечується краще виживання рослин та збереження серед них мутацій з господарсько-корисними ознаками. Не слід допускати великого розриву в часі між обробкою насіння і їх посівом, так як в противному випадку може знизитися схожість і зрости шкідливий ефект. Щоб знизити шкідливу дію мутагенів, оброблене насіння рекомендується промивати в проточній воді. Різні покоління рослин, отриманих з насіння від впливу мутагенами, позначають буквою М з відповідними цифровими індексами: М-1 - перше покоління, М-2 " - друге і т. д. Для одержання господарсько-корисних мутацій у будь-якого сорту рекомендується піддавати мутагенному впливу від 2 до 4 тис. насінин. Відбір мутацій найчастіше проводять у М2. Алетак як в М1 виявляються не всі мутації, його повторюють у М%. Іноді відбір починають і М1. У цьому випадку відбирають домінантні мутації, а також високопродуктивні рослини для подальшого відбору в їх потомстві генних мутацій, не пов'язаних з хромосомними перебудовами. Перше покоління мутантів вирощують при оптимальних умов живлення і зволоження. Рослини М1 обмолочують окремо або спільно. При роздільному обмолоті у другому поколінні висівають індивідуальні потомства (сім'ї) окремих рослин, що полегшує виділення мутацій з господарсько-корисними ознаками. У другому поколінні відбирають мутанти з добре вираженими цінними ознаками і рослини для отримання малих мутацій в наступному поколінні. Надалі мутації піддаються відбору або використовуються в схрещуваннях між собою або з сортами.

До теперішнього часу в світі створено багато мутантних сортів сільськогосподарських рослин. Деякі з них мають істотні переваги в порівнянні з вихідними сортами. Цінні мутантні форми пшениці, кукурудзи, сон та інших польових і овочевих культур отримано в останні роки в науково - дослідних установах.

У Всесоюзному НДІ олійних культур вперше у світовій селекції методом хімічного мутагенезу створений сорт соняшнику Первісток (оливковий мутант), в маслі якого міститься до 75 % олеїнової кислоти. За якістю воно не поступається маслу, що видобувається з плодів субтропічного вічнозеленого оливкового дерева. Багато мутантні сорту в даний час вивчаються у виробничих умовах і випробовуються на сортодільницях Держкомісії з сортовипробувань сільськогосподарських культур. Особливу увагу селекціонерів приваблює використання мутацій карликовості. З цією проблемою в багатьох країнах пов'язане здійснення селекційних програм зі створення короткостеблових сортів зернових культур інтенсивного типу, здатних при зрошенні і внесенні високих доз мінеральних добрив давати врожай зерна 100 ц/га і вище.

Одним з найбільш цінних донорів короткостеблості у пшениці виявився старий японський озимий Norin 10, володіє трьома парами спонтанно виникли рецесивних генів карликовості dw (від англ. dwarf - карлик) з нерівнозначним ефектом (dwx>dw2>засобу). Якщо звичайний сорт має висоту стебла більше 150 см, у напівкарликових сортів з одним геном карликовості висота стебла становить 100-110 см, а у сортів з двома і трьома генами карликовості відповідно 70-90 і 45-50. Виключно ефективною виявилась робота зі створення короткостеблових сортів пшениці з використанням генів Norin 10 в Мексиканській міжнародному центрі по поліпшенню пшениці і кукурудзи (СИММИТ). У багатьох країнах на основі мексиканських карликових пшениць створені власні пристосовані до місцевих умов короткостеблові сорти інтенсивного типу. Поряд з рецесивними генами карликовості сорти Norin 10 в селекції сортів інтенсивного типу використовують домінантні гени, носіями яких є тибетська пшениця Той Роісе (Пус) і родезійський сорт OlsenDwarfs. Ці гени знижують висоту стебла у пшениці ще сильніше, ніж рецесивні. Використовуючи їх, можна створювати ультранизькорослітрехгенні карликові сорти з висотою стебла 30-35 див. Передбачається, що отримання таких сортів дозволить підняти урожайний потенціал пшениці в умовах дуже інтенсивного культури землеробства до 150 ц/га і вище.

У Краснодарському НДІСГ шляхом хімічного мутагенезу отримано карликові мутанти з сортів озимої пшениці Безоста 1 і Миронівська 808. Карликові мутанти Безостой 1, мають хороші якості зерна і більш високу зимостійкість, широко використовуються в гібридизації. На основі мутанта Краснодарський карлик за 6 років виведений сорт озимої пшениці інтенсивного типу Полукарликовая 49. Для одержання високопродуктивних сортів озимого жита селекційними установами нашої країни успішно використовується природний мутант EM-I, несучий домінантний ген короткостеблості. З допомогою карликових мутантів рису вдалося створити сорти, стійкі до полеганкю, чуйні на високі дози мінеральних добрив, а також відрізняються завдяки нейтральній фотоперіодичній реакції високою пластичністю.

Цінні мутантні сорти ячменю отримані в Австрії, ФРН, НДР, США, Чехословаччини, Швеції. У Краснодарському НДІСГ шляхом хімічного мутагенезу із сорти озимого ячменю Заповіт отримано стійкий до вилягання напівкарлик 55М1. В цьому ж інституті отриманий гігантський широколистий товстостеблий мутант вівса і на його основі створено сорт Зелений, дає дуже високий урожай кормової маси.

Використовується мутагенез і для отримання карликових гібридів кукурудзи. У таких гібридів передбачається підвищити врожайність і прискорити дозрівання за рахунок зниження витрат поживних речовин і води на ріст стебла, що одночасно дозволить вирощувати їх при значно більшій густоті стояння рослин і застосовувати в повторних посівах.

Винятково велике значення біохімічних мутацій. Так, у кукурудзи спонтанні мутації білкового комплексу opaque-2 (тьмяний-2) і floury-2 (борошнистий-2) послужили основою для створення гібридів з високим вмістом незамінних амінокислот. Рецесивний ген збільшує вміст лізину в різних генотипах в 1,5-2 рази. На половину домінантний ген fl2 володіє такою здатністю, меншою мірою, під його контролем значно підвищується вміст метіоніну. При цьому скорочується кількість зерна і збільшується вміст інших білків, більш багатих зазначеними амінокислотами. В нашій країні створені перші високолізиновані гібриди кукурудзи Краснодарський 82ВЛ, Краснодарський 303ВЛ, Геркулес Л. В їх білку міститься приблизно в 1,5 рази більше лізину, ніж у звичайних гібридів. Тварини, яких годують зерном високолізинованих гібридів кукурудзи значно збільшують прирости, а витрати кормів при цьому набагато нижче, ніж при раціонах із звичайною кукурудзою.

 

5. Клітинна селекція – процес зростаючого домінування в культурі клітин певного типу, який цікавить дослідника. Це відкриває широкі можливості клітинної селекції при вирішенні багатьох теоретичних і практичних питань біологічної і сільськогосподарської науки. Наприклад, якщо шляхом мутагенезу і селекції відібрати клітину, стійку до засолення або гербіциду, то і одержана з неї рослина-регенерант також повинна бути стійка до цього фактора.

 

За допомогою методів клітинної селекції вже одержано багато біологічних об’єктів, серед яких:

- Картопля, яка стійка до кільцевої гнилі;

- Стійкі до механічного збирання томати;

- Цукрова тростина із стійкістю до склероспоріозу, борошнистої роси та підвищеним вмістом цукру;

-Калус пшениці, який витримує температуру - 40ºC (перспективний напрямок робіт з зимостійкості злакових).

 

На сьогодні більшість експерементів проводяться на модельних об’єктах. Проте саме їх використання дозволяє розробити тонкі методи селекції різних мутантів, визначити можливості клітинної селекції при створенні нових біотехнологій у таких напрямках:

- одержання та вивчення хлорофілдефектних мутантів;

- маркірування сільськогосподарських культур і використання їх у подальших генетично-селекційних дослідженнях;

- одержання більш збалансованого амінокислотного складу білка зернових культур;

- регуляція метаболічних шляхів РНК і ДНК в клітинах;

- використання спецефічних інгібіторів процесів фотодихання і біосинтезу поліамінів як селективних факторів при клітинній селекції;

- селекція мутантів, стійких до дії гербіцидів, засолення, посухи, радіації, екстремальних температур і патотоксинів;

Підводячи деякі підсумки, можна стверджувати, що одержання нових генотипів шляхом клітинної селекції – реальність, яка потребує подальшого вивчення і більш широкого застосування на практиці.

 

6. Кріобіологія (від грецьк. kryos – холод, мороз, лід) – розділ біології, який вивчає дію на живі системи низьких та наднизьких температур (від 0 ºC до абсолютного нуля). Кріостійкість клітин, тканин і органів рослин, їх природний та штучний захист від кріопошкоджень стає актуальною проблемою з теоретичної і практичної точки зору. Це пов’язано з необхідністю збереження генофонду елітних, рідкісних і зникаючих рослин, а також клітинних штамів-продуцентів, які складають основу біотехнологічних виробництв лікарських, харчових та біологічно активних речовин.

Термін «кріозбереження» (анг. cryopreservation) застосовується для позначення складного багатоетапного процесу, метою якого є обмежено тривале зберігання життєздатних клітин, меристем або органів рослин в стані холодового анабіозу. Єдиним надійним засобом для вирішення цієї проблеми є глибокий холод (нижче - 140ºС), який забезпечує використання рідкого азоту (- 196 ºС) або його парів (- 150ºС). Позитивність глибокого заморожування полягає в тому, що при температурах, близьких до - 196 ºС, фактично повністю зупиняються процеси метаболізму клітин і тим самим зберігається їх генетична і епігенетична характеристика. Це дозволяє зберігати і потенційно використати навіть через сотні роківнеобхідний генотип, який буде знаходитись у кріогенному банку рослин.

Кріозбереження як система єдиного екстремального процесу (заморожування –зберігання – розморожування) складається з таких етапів:

- підготовка об’єкту,

- додавання кріопротектора,

 

- заморожування в певному режимі,

- зберігання в рідкому азоті,

- розморожування,

- видалення кріопротекторів (відмивка),

- рекультивація (для клітин),

- регенерація цілих рослин.

 

Найбільш відповідальним етапом кріозбереження вважається процедура заморожування. Цей процес відносно простий для об’єктів здуже низьким вмістом води (пилок, насіння), які можна безпосередньо занурювати у рідкий азот і проводити розморожування на повітрі у звичайних умовах. Труднощі виникають при заморожуванні тканин або органів рослин великого розміру. Збереження життєздатності об’єктів за рахунок зниження фази рідкої води забезпечується програмним заморожуванням у присутності кріопротекторів з постійною малою швидкістю (0,3 – 1 град/хв) до - 40 ºС. Присутність кріопротекторів дозволяє вільній воді вийти з клітин і кристалізуватись вже на поверхні у розчині.

Кріопротектори – це речовини, які зв’язують вільну воду як в міжклітинниках, так і в клітинах; ускладнюють її кристалізацію за рахунок утворення з нею водневих зв’язків; зменшують ущільнення протопластів клітин при заморожуванні. Використовують різноманітні речовини-кріопротектори: диметилсульфоксид(ДМСО), поліетиленгліколь(ПЕГ), поліетиленоксид, етеленгліколь, гліцерин, сахарозу, сорбіт, маніт, лактозу та ін.

На сьогодні успішне кріозбереження клітинних і тканинних культур інвітро здійснено майже для 70 видів рослин, половина з яких – меристеми. Вченими вже одержані рослини-регенеранти картоплі, моркви, гороху, суниць, томатів з меристем, які зберігались при наднизьких температурах. Активно проводяться дослідження з кріозбереження клітинних штамів-продуцентів економічно важливих речовин. Таким чином, захист і збереження рослинних ресурсів являє собою гідну задачу для біотехнології.

 





sdamzavas.net - 2019 год. Все права принадлежат их авторам! В случае нарушение авторского права, обращайтесь по форме обратной связи...