Главная Обратная связь

Дисциплины:






Тема Т14. Одержання посівного матеріалу



Для виробництва посівного матеріалу використовують вихідний штам продуцентів, одержуваний з лабораторії чистих культур. Для готування необхідної кількості посівного матеріалу на заводі організується цех чистої культури, що веде постадійне вирощування посівного матеріалу в асептичних умовах, які гарантують розвиток тільки продуцента й повну відсутність інших мікроорганізмів. Технологія одержання виробничого посівного матеріалу залежить від виду продуцента й способу його культивування.

Зберігання вихідних штамів продуцентів. Це відповідальне й важке завдання. Особливі труднощі виникають у випадках, коли вихідним штамом є мутант, тому що при його тривалому зберіганні не виключена можливість прояву спонтанної мінливості культури. Для запобігання цього необхідно періодично проводити розсів культури й перевірку її однорідності як по морфологічним, так і по фізіологічним ознакам. При розсіванні з колонії, що дає найкращі показники, роблять новий розсів в 30-40 пробірок і потім перевіряють на 5-б пробірках продуктивну здатність відібраної культури.

Жоден із численних способів зберігання живих культур мікроорганізмів не дає повної гарантії стабільності штаму й збереження його продуктивності. Найпоширенішим способом підтримки вихідної культури продуцента є висів мікроорганізмів у пробірки на скошені агаризовані середовища з оптимальним для кожного штаму складом і вирощування його до певного віку в оптимальних умовах.

Готову культуру в пробірках поміщають у холодильник і зберігають при температурі 3-4 °С. Пересівання культур проводять через певні проміжки часу з таким розрахунком, щоб щонайкраще зберегти фізіолого-біохімічні властивості штаму. При пересіваннях варто переносити тільки спори або невеликі шматочки міцелію без поживного середовища, щоб у свіже живильне не середовище вносити продукти метаболізму. Для тривалого зберігання деяких штамів доцільно використовувати бідні цукрами крохмальні середовища.

Більше тривалий час можна зберігати культуру під шаром вазелінового масла. Для цього доцільно використовувати вазелінове масло медичного призначення. Воно не повинне містити токсинів і окислених продуктів. Шар масла повинен бути тільки на 1 см вище агарового зрізу, інакше можлива загибель культури через недостачу кисню. Попереднє масло стерилізують при 0,15 МПа протягом 1,5 ч. Культуру заливають стерильним маслом після того, як вона досягне повної фізіологічної зрілості. Для цього способу зберігання найкращим середовищем уважається картопляно-мальтозний агар.

Відомі способи зберігання культур при температурах від -11 до -14°С. У цих умовах багато культур повністю зберігають активність протягом 10-16 міс.



Грибні культури успішно зберігають у замороженому стані в атмосфері рідкого азоту при температурах від -165 до -196 °С. Мікроскопічні гриби заморожують в 10%-вому водному розчині гліцерину в запаяних ампулах. Ампули із замороженими культурами поміщають у контейнер з рідким азотом, де їх зберігають 5 і більше років.

Перспективним варто визнати спосіб зберігання культур у ліофілізованому стані. Культуру мікроорганізму вносять у захисне середовище, у якості якого можна використовувати цукрожелатинове середовище й ін., поміщають у стерильні ампули, закривають стерильними ватними тампонами й швидко заморожують при температурах від -35 до -78°С. Потім ампули переносять у вакуум-сушильний апарат і висушують при залишковому тиску 13,33-1,33 Па протягом 25-30 ч. Ліофільно висушені культури можуть зберігатися до 5-6 років, не втрачаючи здатності синтезувати ферменти.

Вихідний штам може зберігатися на зерні або в ґрунті. Для цього ґрунт стерилізують і вносять у неї культуру продуцента. Штам у таких умовах може зберігатися довго. При поновленні культури змив із ґрунту висівають на чашки Петрі. Якщо продуцент зберігають на пшоні, то для цього пшоно, очищене від домішок, кип'ятять у мінімальній кількості води (0,8 л на 1 кг пшона), розпарюють 30 хв, потім розбирають і видаляють грудки, що утворилися, а остигле пшоно по 15-16 г засипають у стерильні флакони місткістю 250 мл, які потім стерилізують при 0,1 МПа протягом 40 хв. На стерильне розпарене пшоно засівають 2 мл густої суспензії конідій або 3 мл дводобових вегетативних міцеліїв, вирощених в колбах на качалках. Культуру продуцента вирощують при періодичному струшуванні при температурі 25-30° С. Зрілу культуру висушують до вологості 7-8% у вакуумі при 25 °С на протязі 60-70 год і в такому вигляді зберігають від 1 до 3-5 років.

Підготовка посівного матеріалу для поверхневого культивування. Цей спосіб застосовують в основному для культивування мікроскопічних грибів. Посівний матеріал у цьому випадку може бути приготовлений двох видів: у вигляді культури, вирощеної на твердому живильному , середовищі й міцеліальної маси продуцента, вирощеної на рідкому середовищу глибинним способом. Незалежно від виду посівного матеріалу послідовність операцій однакова: 1) готування поживного середовища; 2) стерилізація поживного середовища й з апаратури; 3) охолодження середовища з дотриманням правил асептики до температури росту культури; 4) засівання середовища вихідним штамом продуцента; 5) вирощування культури продуцента до певного віку; 6) консервування посівного матеріалу.

Готування поживного середовища зводиться до точного дозування окремих компонентів середовища і їхньому змішуванню в певній послідовності. Цей процес можна вести в спеціальній ємності - змішувачі або ж в апарату, призначеному для стерилізації. Умови стерилізації залежать від складу середовища і його стану. Всю апаратуру й комунікації стерилізують гострою парою при надлишковому тиску 0,15-0,35 МПа. Прохолоджувати середовище можна стерильним холодним повітрям або холодною водою через глухі поверхні теплообміну. Засівання середовища ведуть водною суспензією продуцента з дотриманням правил асептики.

Вирощування проводиться в спеціальному цеху. Готовий посівний матеріал консервують або висушуванням, або зберіганням при низьких температурах. Строки зберігання встановлюються для кожного продуцента експериментально.

Посівну культуру на твердому живильному середовищі готують, вирощуючи мікроорганізми в зростаючій кількості в три або чотири етапи. Склад поживного середовища визначається властивостями мікроорганізму - продуцента. Найчастіше для цієї мети використовують зволожену пшеничну дерть. Іноді до середовища додають солодові ростки, тирсу, буряковий жом. Залежно від продуцента вологість середовища після стерилізації становить 45-56 %.

Вихідну музейну культуру продуцента на твердому агаризованому середовищі пересівають для відновлення спочатку на 1 -1,5 г зволоженої стерильної дерті у пробірку (рис. 14.1). Пробірку поміщують у термостат і вирощують культуру при оптимальній температурі до рясного конідієутворення. Вміст пробірки переносять в 3-4 колби місткістю 0,75-1 л, що містять 40-100 г пухкого вологого стерильного середовища, і вирощують продуцент за тих самих умов.

Підготовлений у колбах у достатній кількості посівний матеріал використовують для засіву поживного середовища, яке попередньо стерилізують у біксах при 0,15 МПа протягом 60 хв. Засіяне середовище розміщається на стерильних кюветах. Звичайно посівні кювети мають прямокутну форму, виконуються з оцинкованого неперфорованого заліза і постачені кришками, які мають одне чи два отвори, що закриваються ватно-марлевими серветками. Трьох колб посівної культури досить для засіву 20-25 кювет. Засіяне середовище розкладають у посівні кювети шаром 0,8-1,2 см; між кюветою і кришкою прокладають шар непроклеєного паперу для запобігання можливої конденсації вологи на кришці й створення зон зайвого зволоження зростаючої культури.

Закриті кювети із середовищем поміщають у спеціальні ростові камери для посівної культури на стаціонарні стелажі або етажерки.

У камері підтримують певну вологість і температурний режим, оптимальні для вирощуваного штаму й забезпечуючі рясне конідієутворення. Камери заповнюють кюветами з розрахунку не більше 1-2 кг засіяного середовища (по сухій масі) на 1м3 об’єму камери, повітрообмін у такій камері повинен бути 2-3м3/(м3·год).

Готовий посівний матеріал знімають із кювет за допомогою ручного маніпулятора й у вологому стані поміщають у стерильні пакети, які поміщають на зберігання в камеру з температурою не вище 4°С до закінчення його мікробіологічної й біохімічної перевірки. Тривалість зберігання посівного матеріалу не повинна перевищувати 5-6 днів, тому що волога культура навіть при низькій температурі поступово стає малопридатною для одержання активної виробничої культури.

Приготовлена вищеописаним способом посівна культура повинна містити не менше 0,7 млрд. спор в 1 гр. Схожість спор повинна бути 86-90%. Посівний матеріал не повинен містити сторонньої мікрофлори.

 

1 – вихідна культура продуцента в пробірках; 2 - культура в колбах на дерті; 3– культура на дерті в банці Протод’яконова; 4 – ємність для підігрівання води; 5 – стерилізатор; 6 – ємність для зберігання дерті; 7 – дозатор; 8 – бікс з дертю; 9 – автоклав; 10 – бікс зі стерильною дертю; 11 – ватно-марлева салфетка; 12 - кришка для кювети; 13 – кювета на завантаженні; 14 – стіл; 15 – завантажена кювета; 16 – ростова камера; 17 – стелажі; 18 – викид повітря із калорифера в атмосферу; 19 – фільтри для повітря; 20 – вентилятор, 21 – калорифер; 22 – відбійники; 23 – ручний маніпулятор для розвантаження кювет; 24 – готова посівна культура; 25 – стерильний флакон; 26 – брудна кювета; 27 – ванна для миття кювет; 28 – сушка кювет; 29 – шафа для стерилізації кювет; 30 – стерильна кювета; 31 – прохолодна кімната; 32 – ємність для стерилізації і охолодження води; 33 – ємність для поверхнево-активної речовини; 34 – дозатор; 35 – ємність для приготування посівної суспензії; 36 – насос.

Рисунок 14.1- Технологічна схема отримання посівної культури для поверхневого культивування

 

Якщо посівний матеріал задовольняє всім вимогам, його передають із холодного приміщення у відділення готування посівної суспензії. Посівний матеріал змішують у спеціальній посудині зі стерильною водою й невеликою кількістю поверхнево-активної речовини для підвищення змочуваності спор. Така суспензія і є готовим посівним матеріалом.

Використання міцеліальної маси мікроскопічних грибів в якості посівного матеріалу при глибинному методі культивування відомо давно, однак застосування його як посівного матеріалу при поверхневому способі культивування стало поширюватися тільки в останні 20 років.

Принципова технологічна схема одержання посівного матеріалу глибинним способом у вигляді міцеліальної маси показана на рис. 14.2.

 

1 – вихідна культура продуцента в пробірках; 2 – культура в колбі на твердому сусло-ростковому середовищі; 3 – культура на дерті в колбі; 4 – ємність для одержання глибинної культури; 5 – качалка; 6 – прохолодна кімната; 7 – інокулятор; 8 – фільтри для очистки повітря.

Рисунок 14.2 - Технологічна схема отримання міцеліальної маси продуцента

 

Вихідна культура продуцента із пробірки пересівається в колбу місткістю 0,5-0,75 л з 25-40 мл агаризованого середовища, культура рівномірним тонким шаром розподіляється по внутрішній поверхні колби обертовим рухом. Культивування продуцента ведуть поверхневим способом до рясного конідієутворення. З колби конідії продуцента разом з міцелієм, не порушуючи цілісності агаризованого середовища, змивають 100-150 мл стерильної води й засівають нею 15-20 колб місткістю 0,5-0,75 л зі зволоженою дертю, на яких ведеться вирощування до рясного конідієутворення. Одна колба з культурою на дерті використовується для готування посівної суспензії й засіву двох посудин місткістю 8-10 л (коефіцієнт заповнення 0,3-0,4). У якості основного поживного середовища частіше всього використовується сусло-росткове середовище, що складається з 3 частин солодкого солодового сусла з концентрацією сухої речовини 8 % і 1 частини витяжки із солодових ростків, отриманої при настоюванні паростків в 5 частинах води при 18-20 °С на протязі 1 год. Посудини з рідким поживним середовищем поміщають на кругову качалку із частотою обертання 200-220 хв-1. Температура й тривалість культивування вибираються оптимальні для даного продуцента.

Цей спосіб зручний тільки при невеликій продуктивності заводу або цеху - до 3-6 т готової культури в добу. При більшій продуктивності підприємства доцільно одержувати посівний матеріал у вигляді міцеліальних мас не на качалках, а в невеликих ферментаторах (інокуляторах). Готовим посівним матеріалом звичайно служить молода, що активно росте культура і перебуває в експонентній фазі розвитку. Такий спосіб дозволяє в 2,5-3 рази скоротити тривалість готування посівного матеріалу, значно (в 4-5 разів) зменшити необхідну площу цеху чистої культури, поліпшити умови праці, а головне - знизити конідієутворення в готовій виробничій культурі при її поверхневому вирощуванні.

Підготовка посівного матеріалу для глибинного культивування. Для засіву виробничого середовища при глибинному способі культивування посівний матеріал готовлять також глибинним способом. Вид посівного матеріалу залежить від продуцента: для грибів і актиноміцетів - це міцеліальна маса, а для бактерій - молода культура зі спорами.

Етапи одержання посівної культури наступні: 1) відновлення вихідної культури на агаризованому середовищі; 2) вирощування культури на рідкому середовищі в колбах на качалці; 3) культивування продуцента в малому, а потім, якщо потрібно, у великому інокуляторі. Посівна доза при засіві глибинною культурою порівняно більша - від 1 до 15 %, тому число стадій і обсяг інокуляторів визначаються тільки продуктивністю підприємства й оптимальною нормою витрати посівного матеріалу для даного продуцента.

Технологічна схема готування посівного матеріалу для глибинного культивування наведена на рис. 14.3. Вихідний продуцент із пробірки 1 пересівають на матраци 2 з більшою кількістю агаризованого середовища. З матраців культуру змивають стерильною водою й у вигляді суспензії використовують для засіву колб 3. Частіше засівши ведуть відразу із пробірки в колби. Колби закріплюють на качалці 4, що струшує рідину в колбах і сприяє розчиненню кисню в середовищі, що забезпечує нормальні умови життєдіяльності мікроорганізмів. Готову культуру з колб збирають в одну ємність при дотриманні правил асептики н переносять у малий інокулятор 5 зі стерильним охолодженим середовищем. Засів ведуть у полум'ї палаючого смолоскипа через посівний патрубок інокулятора. У малий інокулятор через індивідуальний фільтр 6 подається стерильне повітря. Підготовку, стерилізацію й охолодження поживного середовища здійснюється в малому інокуляторі. Піногасник стерилізують і прохолоджують у спеціальній ємності й подають у малий інокулятор у міру потреби.

Для великого інокулятора 7 середовище готують, як правило, у спеціальних апаратах і подають її в стерильний, охолоджений до 60-70 °С інокулятор. Готову культуру з малого інокулятора передавлюють стерильним повітрям у великий інокулятор на свіже поживне середовище.

Рисунок 14. 3 - Технологічна схема отримання глибинної посівної культури

Культивування на всіх стадіях ведеться при оптимальній температурі й аерації. Звичайно готовий посівний матеріал відразу ж передають у виробництво. Якщо ж виникають непередбачені затримки, то посівний матеріал безпосередньо в інокуляторі прохолоджують до 8-10 °С, але зберігають не більше 3-4 год, інакше його якість може різко погіршитися. Посівний матеріал, отриманий будь-яким способом, піддається мікробіологічному й біохімічному контролю.

Посівний матеріал уважається активним, якщо він забезпечує нормальну тривалість культивування на виробничому середовищі й досягнення максимальної продуктивності за цей строк. Він не повинен містити сторонньої мікрофлори.

Дозування й вік посівного матеріалу. Цей фактор впливає на хід культивування й біосинтез ферментів. Внесення великої кількості посівного матеріалу може, з одного боку, прискорити ріст культури, але, з іншого боку, у результаті більше рясного спороутворення при поверхневому способі культивування збільшуються втрати на дихання. Занижені дози посівного матеріалу приводять до різкого вповільнення процесу культивування.

У зв'язку із цим для кожного виробничого штаму встановлюється оптимальне дозування посівного матеріалу. Для забезпечення нормального розвитку мікроскопічних грибів при поверхневому з культивування в умовах стерильного середовища й знеплідненого повітря досить внести 0,02-0,05 % посівний спороутворюючої культури з титром 106 спор на 1 г. У заводських умовах, де часто неможливо домогтися повної стерильності виробничих середовищ, посівний матеріал вносять із розрахунку 0,2-1,0 % до маси сировини, що переробляється.

При використанні міцеліального посівного матеріалу його витрата дорівнює 1,5-2,5%. Використання глибинного посівного матеріалу трохи затягує процес росту виробничої поверхневої культури, але він більше перспективний, тому що полегшується праця робітників, спрощується процес одержання стандартної посівної культури й дозволяє скоротити площі посівних цехів. Дозування глибинної посівної культури залежить від виду використовуваних мікроорганізмів. Якщо це спорова культура, то витрата посівного матеріалу залежить від титру посівного матеріалу: звичайно він становить від 0,2 до 1,0%; для мікроскопічних грибів родів Aspergіllus, Trіchoderma, Endomycopsіs він становить 1,0-2,5%. Для продуцентів з ослабленою вегетацією й актиноміцетів посівна доза зростає до 5-6%, а в деяких випадках - до 15-20 %.

Вік глибинної посівної культури відповідає логарифмічній фазі росту; звичайно це інтенсивно зростаюча культура у віці 18-24 год. Оптимальний вік установлюється експериментально для кожної культури.

 

Контрольні питання до теми Т14

1. Як зберігаються вихідні штами продуцентів?

2. Як відбувається підготовка посівного матеріалу для поверхневого культивування?

3. Технологічна схема отримання посівної культури для поверхневого культивування..

4. Технологічна схема отримання міцеліальної маси продуцента.

 





sdamzavas.net - 2017 год. Все права принадлежат их авторам! В случае нарушение авторского права, обращайтесь по форме обратной связи...