Главная Обратная связь

Дисциплины:






Методы выделения и очистки белков



Последовательность операций по выделению белков:

1) измельчение биологического материала (гомогенизация);

2) перевод белков в растворенное состояние – экстракция;

3) выделение исследуемого белка из смеси других белков, т.е. очистка и получение индивидуального белка.

 

Различают качественный и количественный анализ белков в растворах. Явление денатурации применяют для качественного анализа присутствия белков в растворах. Для этого пробу с исследуемой жидкостью кипятят после её подкисления. Образующееся при этом помутнение связано с денатурацией белка. Часто используют осаждение органическими кислотами: сульфосалициловой и трихлоруксусной. Для количественного анализа белков определяют белковый азот. Для этого пробу сжигают при высокой температуре в присутствии Н24 и перекиси водорода (окислитель). Происходит минерализация, при этом азот в форме аммиака связывается с серной кислотой (сульфат аммония). Количество сульфата аммония определяют или реактивом Несслера, или после перегонки аммиака титрометрически. Значительно чаще для количественного определения используют цветные реакции (биуретовая или реакция на фенольные группы – метод Лоури). Биуретовая реакция основана на том, что в щелочной среде ионы меди реагируют с пептидными группировками, образуя комплексные соединения, окрашенные в фиолетовый цвет. Интенсивность окраски фотометрируется. Сочетание биуретовой реакции и реакции на фенольные группировки используется в методе Лоури. Для количественного определения индивидуальных белков в их сложных смесях популярны иммунологические методы. При взаимодействии белка со специфической антисывороткой образуется мутный раствор. Интенсивность помутнения может быть измерена колориметрическими методами или методами, применяемыми в иммунологии.

Таким образом, к методам выделения и очистки белков относят: электрофорез, высаливание, денатурацию, количественный анализ и фракционирование.

Фракционирование белков связано с высаливанием и заключается в том, что комбинируя разные концентрации солей и спирта или ацетона, действующих при непродолжительном контакте с белками подобно солям щелочноземельных металлов, белки плазмы крови разделяют на ряд фракций, которые затем используют для получения чистых белковых препаратов. Высаливание не вызывает нарушений структуры белков, поэтому после удаления солей эти препараты сохраняют свое биологическое действие. Но спирт или ацетон можно использовать только при низких температурах (-20ºС).

Приложение № 3.

 





sdamzavas.net - 2019 год. Все права принадлежат их авторам! В случае нарушение авторского права, обращайтесь по форме обратной связи...