Главная Обратная связь

Дисциплины:






ЭЛЕКТРОФОРЕЗ И РЕНТГЕНОВСКАЯ ДИФРАКЦИЯ



 

Развитие новых химических и физических инструментов биологических исследований в первой половине XX в. сделало возможным выявление тонких деталей больших протеиновых молекул, которые являются сущностью жизни.

По сути, возникла новая наука на грани физики, химии и биологии, которая исследовала механизм функционирования органических молекул.

Эта наука — молекулярная биология — стала особо важной после Второй мировой войны.

В 1923 г. шведский химик Теодор Сведберг (1884 — 1971) представил новый метод определения размера протеиновых молекул. Этот метод назывался ультрацентрифугированием. Термическое движение молекул воды поддерживает молекулы протеина в суспензии: на них не действует сила гравитации; однако при центростремительных силах, создаваемых в центрифуге, молекулы протеина оседают. По скорости оседания можно определить молекулярный вес протеина.

Протеин средней массы, например, гемоглобин, имеет молекулярную массу 67 000. Другие протеиновые молекулы еще тяжелее.

Размеры и сложность протеиновых молекул определяют их электрический заряд. Каждый протеин имеет свой положительный или отрицательный заряд, который меняется в зависимости от изменения кислотности среды.

Если протеиновый раствор поместить в электрическое поле, индивидуальные молекулы протеина движутся либо к положительному, либо к отрицательному электроду с определенной скоростью, заданной силой тока, размерами и формой молекулы и т. д. Скорость у каждого протеина строго своя.

В 1937 г. шведский биохимик Арне Вильгельм Каурин Тиселиус (1902 — 1971) изобрел метод электрофоретического и хроматографического анализа. Поскольку каждый компонент раствора движется строго со своей скоростью, их можно разделить. Более того, определенные цилиндрические линзы позволяют видеть изменения дифрагируемого света при прохождении его через раствор. Изменения в рефракции раствора можно сфотографировать. По интенсивности волны света можно подсчитать количество протеина каждого вида в данной смеси.

Были подвергнуты электрофорезу и сфотографированы протеины плазмы крови. Их разделили на фракции, включая альбумин, три группы глобулинов. Оказалось, что фракция гаммаглобулина содержит антитела.

Ультрацентрифугирование и электрофорез зависят от свойств протеиновой молекулы. Но наиболее эффективен способ рентгеновской дифракции. Когда рентгеновский луч проходит через вещество, создается определенное распределение частиц. Х-луч фиксируется на фотопленке, и по рассеянию луча можно идентифицировать протеин.

В 1951 г. американский химик Лайнус Полинг (1901—-1994) показал, что цепь аминокислот в белке имеет форму спирали.



По виду рентгеновской дифракции можно делать математические просчеты. В помощь биохимикам как раз в эти годы были разработаны компьютеры. Первой была обсчитана молекула не протеина, но витамина.

С использованием рентгеновской дифракции и компьютерной обработки впервые в 1960 г. английские ученые Макс Фердинанд Перутц и Джон Коудери Кендрю показали миру трехмерную молекулу миоглобина со всеми наличествующими аминокислотами в ее составе.

ХРОМАТОГРАФИЯ

Использование физических методов исследования, например дифракции рентгеновских лучей, очень помогает в работе химикам, если предварительно исследована химическая природа составляющих молекулы и получена ее цельная картина. В таком случае физический метод будет направлен на практическое измерение и уточнение.

В случае с протеинами химический прогресс был неспешен. В XIX в. было лишь показано, что молекула протеина состоит из аминокислот. В начале XX в. немецкий химик Эмиль Херманн Фишер (1852 — 1919) определил, как именно аминокислоты соединены между собой в молекуле протеина. В 1907 г. он собрал вместе 15 молекул аминокислот и 3 других в весьма простую молекулу протеиновой субстанции из 18 звеньев.

Но какова структура гораздо более сложных молекул, встречающихся в природе? Какова точная численность каждого типа аминокислот в- данной протеиновой молекуле? Прямого ответа на этот вопрос не последовало, поскольку для него предстояло разбить молекулу протеина на смесь индивидуальных аминокислот и определить относительные количества каждого компонента методами химического анализа.

Для времени, в котором жил Фишер, это было невыполнимо. Некоторые из аминокислот достаточно схожи по структуре между собой, а методы не были столь тонкими, чтобы определить их избирательно.

Ответ на проблему пришел с методикой, впервые увидевшей свет в 1906 г. и основанной на трудах русского ботаника Михаила Цвета (1872 — 1919). Он работал с растительными пигментами и нашел способ отделять один от другого нехимически. Ему пришло в голову дать смеси стекать по трубке, опудренной окисью алюминия. Разные субстанции в смеси пигментов прилипали к частицам порошка с различной силой. По мере промывания смеси свежим растворителем компоненты разделялись, осаждаясь; те, которые притягивались с меньшей силой, промылись вниз первыми; в конце концов смесь была разделена на компоненты, каждый со своим оттенком. Ответ был как бы «написан цветом», поэтому автор назвал методику греческим термином «хроматография» (буквально: «написано цветом»),

Работа Цвета в то время не вызвала интереса, но в 1920-х годах Вилштеер сделал методику популярной. Хроматография стала широко использоваться для разделения смесей.

Необходимая модификация к методике Цвета пришла в 1944 г. и совершила буквально революцию в биохимии. Английские биохимики Арчер Джон Портер Мартин (род. 1910) и Ричард Лоуренс Миллингтон Синг (1914—1994) разработали методику хроматографии на простой фильтровальной бумаге.

Капля смеси аминокислот стекала до конца бумажной полоски, а затем по полоске способом капилляров поднимался специальный растворитель. По мере того как растворитель смачивал высохшие следы смеси, аминокислоты по очереди «поднимались» по бумажной полоске, каждая со своей скоростью. Их положение на полоске определялось наиболее подходящим химическим или физическим методом. Количественный анализ содержания аминокислот можно было провести без особого труда.

Бумажная хроматография завоевала немедленную популярность. Без дорогостоящего оборудования, просто и быстро она позволяла точно разделять сложнейшие смеси. Методика стала приложимой к любой ветви биохимии: в частности, к фотосинтезу по Калвину.

В особенности хроматография позволила определять точные количества аминокислот в молекуле данного протеина, будто то была простая молекула обычного вещества.





sdamzavas.net - 2019 год. Все права принадлежат их авторам! В случае нарушение авторского права, обращайтесь по форме обратной связи...