Главная Обратная связь

Дисциплины:






Этапы приготовления гистологического препарата для электронной микроскопии. Сущность и методы фиксации, уплотнения, микротомирования и контрастирования.



Этапы приготовления:

1. Взятие материала (во время операции, у трупа, пункции, мазок крови и тд.).

2. Фиксация материала. Фиксация полученного гистологического материала ~ это воздействие на него химическими веществами, а также физическими факторами, что препятствует дальнейшему разрушению тканей объекта, сохраняет его структуру.

Физические фиксирующие факторы - замораживание (твердой углекислотой, в жидком азоте, кислороде и т.д.), воздействие высокой температуры, рентгеновское излучение. Все эти факторы вызывают гибель бактерии и инактивируют собственные ферменты тканей, способствуя сохранению гистологического материала.

Химические фиксаторы также вызывают гибель микробов и собственных ферментов тканей, стабилизируют структуру объекта. Различаютпростые и сложные химические фиксаторы.

Простые фиксаторы состоят из одного химического вещества (например, формалин, спирт, уксусная кислота и др.). Эти фиксаторы, однако, приводят к определенным нарушениям структуры гистологического материала.

Так, формалин вызывает сморщивание его, уменьшение в размерах. Уксусная кислота, наоборот, вызывает набухание. Поэтому чаще применяют сложные фиксаторы, в которых отрицательное действие простых фиксаторов нивелируется. Например, фиксатор ФСУ состоит из 4 частей формалина, 1 части спирта и 0,3 частей уксусной кислоты. Этот фиксатор вызывает весьма незначительные изменения структуры объекта. Известно множество и других сложных фиксаторов.

 

3. Промывка.

4. Обезвоживание

5. Уплотнение материала. Проводится для того, чтобы из объекта можно было приготовить тонкие срезы. Выполняется путем заливки в парафин, целлоидин или целлоидин-парафин. Можно уплотнить материал и путем замораживания в жидком азоте, что используется в гистохимии ферментов. При этом сохраняются интактными все ферменты.

6. Изготовление срезов.Этот этап выполняется при помощи приборовМИКРОТОМОВ. В них используются очень острые ножи, которые закрепляются неподвижно, Объект, залитый в парафин, движется вперед в течение каждого цикла (оборота) на определенное расстояние (3—10 мкм), и с его поверхности срезаются срезы такой же толщины(ротационный микротом). В микротомахдругих конструкций(санные микротомы) неподвижно закрепляется объект, а нож движется свободно вперед-назад в горизонтальной плоскости и после каждого цикла движений опускаетсяна заданную толщину, производя срезы.

 

Рис. Общий вид ротационного микротома: 1. станина; 2. маховик; 3. ножедержатель инож; 4. объектодержатель и объект: 5. транспортерная лента для готовыхсрезов.

 

7. Удаление из срезов парафина (с помощью растворителей – ксилол, толуол, бензол и др.).



8. Окрашивание срезов.Окрашивание срезов (в световой микроскопии) или напыление их солями металлов (в электронной микроскопии) применяют для увеличения контрастности изображения отдельных структур при рассматривании их в микроскопе. Методы контрастирования солями тяжелых металлов позволяют исследовать в электронном микроскопе отдельные макромолекулы — ДНК, крупных белков (например, миозин). При негативном контрастировании изучают агрегаты макромолекул (рибосомы, вирусы) либо белковые филаменты (актиновые нити).

 





sdamzavas.net - 2019 год. Все права принадлежат их авторам! В случае нарушение авторского права, обращайтесь по форме обратной связи...