Этиологическая роль вируса папилломы человека в развитии рака шейки матки: генетические и патогенетические механизмы, возможности терапии и профилактики

В.И.Киселев, Л.А.Ашрафян, С.О.Бударина, О.И.Киселев, М.А.Пальцев, В.И.Кулаков, В.Н.Прилепская

Институт молекулярной медицины Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова (ректор – акад. РАН и РАМН М.А.Пальцев), Научный центр рентгенорадиологии (дир. – акад. РАМН проф. В.П.Харченко) МЗ и СР РФ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии (дир. – акад. РАМН В.И.Кулаков) РАМН, Москва

Геном вируса папилломы человека (ВПЧ) представлен циркулярной двуспиральной ДНК с молекулярной массой около 8 тыс. пар оснований, кодирующих всего 8 открытых рамок считывания. В процессе репликативного цикла геном ВПЧ экспрессирует от 8 до 10 белковых продуктов, и только для одного из них установлена ферментативная функция. Ранний белок Е1 обладает функциями АТФазы и хеликазы. Хеликаза представляет собой фермент, расплетающий ДНК, и является известной мишенью для лекарственных препаратов.
Учитывая относительную простоту генома ВПЧ, целесообразно рассмотреть его основные функции и продукты экспрессии. На рис. 1 приведена физическая карта генома ВПЧ-11, на которой видно, что 8 открытых рамок считывания кодируют 6 ранних белков и 2 поздних. Наиболее важными с точки зрения онкогенных потенций ВПЧ являются онкобелки Е5, Е6 и Е7. Белок Е4 взаимодействует с цитоскелетом эпителиальных клеток, что приводит к дезинтеграции клеточного скелета. Белки Е1 и Е2 представляют собой хеликазу и транскрипционный модулятор соответственно. Поздние белки H1 и Н2 относятся к капсидным белкам. В частности, H1 является основным капсидным белкам, а белок Н2 – минорным капсидным белком с ДНК-связывающими функциями [1, 2].
Следует подчеркнуть, что даже геном вируса гриппа, состоящий из 8 фрагментов РНК и кодирующий 10 белков, является в генетическом отношении более сложным. Однако несмотря на столь примитивную организацию генома ВПЧ, этот вирус представляет собой особую опасность своими отчетливо выраженными онкогенными потенциями [1–4].

Онкобелки ВПЧ
Онкобелок Е5
Онкобелок Е5 относится к белкам со слабой трансформирующей активностью в отношении клеток грызунов. При онкогенной трансформации клеток в своей активности он зависит от белка Е7. В настоящее время доказано, что иммортализация кератиноцитов происходит под влиянием белков Е5 и Е7. На основании детальных исследований вируса бычьей папилломы установлено, что белок Е5 нарушает процессы передачи клеточных сигналов на уровне лиганд-рецептор. В частности, фосфорилирование рецептора эпидермально-ростового фактора (EGF) значительно выше в присутствии EGF и Е5 по сравнению с физиологическими условиями, когда присутствует только EGF. Установлено, что белок Е5 способен к образованию комплексов с Н+ АТФазой вакуолей и может ингибировать повышение концентрации водородных ионов (рН) в эндосомах, что является необходимым условием для процессинга рецептора EGF при взаимодействии с лигандом, т.е. эпидермально-ростовым фактором.
Поскольку функция онкобелка Е5 состоит в разрыве "цепочки" лиганд-рецепторзависимой передачи клеточных сигналов, восстановление нормального пути рециклизации рецептора через эндосомы представляется перспективной "мишенью" для создания противовирусных препаратов в лечении ВПЧ-инфекции. В частности, может иметь значительные перспективы создание антагонистов онкобелка Е5 или агонистов протонного насоса эндосом [5].
Следует также отметить, что ген, кодирующий онкобелок Е5, обычно делетирован в клетках рака шейки матки (РШМ). Это происходит при интеграции ДНК ВПЧ в клеточный геном при онкогенной трансформации эпителиальных клеток. Установлено, что активность онкобелка Е5 в стимуляции пролиферации кератиноцитов важна только как пусковой механизм на стадии предраковых заболеваний шейки матки и далее несущественна при злокачественной опухоли [1, 5].
Попытки найти ингибиторы белка Е5 и его инициирующей активности в пролиферации эпителиальных клеток среди низкомолекулярных веществ пока не увенчались успехом. Те препараты, которые проявляли активность в отношении одного типа ВПЧ, были неактивны по отношению к другим. Это свидетельствует о достаточно высокой вариабельности этого белка, что затрудняет идентификацию домена-"мишени" для поиска и дизайна противовирусных препаратов. Неизвестно также, каким образом и с каким клеточным белком (например, тирозинкиназой) взаимодействует белок Е5, промотируя предраковую трансформацию эпителиальных клеток. Поэтому в отношении препаратов, направленных на инактивацию онкобелка Е5, в настоящее время нет оснований сообщить ничего оптимистичного.

Онкобелок Е6
Онкобелок Е6 онкогенных типов ВПЧ (типов 16 и 18) способен вызвать иммортализацию эпителиальных клеток молочной железы. Белки Е6 и Е7 кооперативно вызывают иммортализацию первичных фибробластов человека и кератиноцитов. Онкобелок Е6 высокоонкогенных типов ВПЧ классифицируется как белок высокого риска (high risk E6 proteins), взаимодействует с антионкобелком Р53 и образует с ним устойчивый комплекс. Это приводит к быстрой протеолитической деградации Р53 в убиквитин-зависимом пути протеолиза. В противоположность белкам высокого риска белки Е6 низкого риска ВПЧ типов 6 и 11 неспособны к образованию комплексов с Р53 инфицированных клеток, что согласуется с отсутствием у этих типов ВПЧ онкогенных потенций. Еще раз следует подчеркнуть, что в настоящее время установлена отчетливая корреляция между носительством генитальных ВПЧ, иммортализацией ими кератиноцитов человека, протеолитической дестабилизацией Р53 и ассоциацией определенных типов (типы 16 и 18) ВПЧ с опухолями человека [1, 5].
Недавно выявлены новые клеточные белки, с которыми онкопротеин Е6 взаимодействует в инфицированных клетках. Среди них обращает на себя внимание белок Е6ВР, который in vitro связывается только с белками Е6 высокого риска, что свидетельствует о возможном участии этого процесса в онкогенезе. Известную регуляторную роль Са++-ионных каналов в клетках, инфицированных ВПЧ, предстоит еще исследовать. Кроме этого, онкобелки Е6 высокого риска взаимодействуют также с ПДНС-белком, связывающимся с геном опухолевого супрессора аденоматозного полипоза кишечника, который выявляется в мутантной форме в большинстве кишечных раков [1]. Более того, именно белок Е6 связывается с интерлейкином-18, являющимся основным индуктором g-интерферона (ИФН), что приводит к блокаде реакций клеточного цитотоксического иммунитета [6]. Установлено действие белков Е6/Е7 на экспрессию гена, кодирующего ИЛ-18 [6], что свидетельствует о наличии у ВПЧ специфического механизма иммуносупрессии и ускользания от иммунного ответа [6].
Вместе с тем следует отметить, что онкобелок Е6 вряд ли можно отнести к ключевым молекулярным мишеням. Его функция реализуется в отношении онкогенеза в очень узком интервале жизненного цикла ВПЧ и уже не играет роли в дальнейшем развитии опухоли в связи с частой делецией гена Е6 в интегрированном геноме ВПЧ [5].

Онкобелок Е7
Онкобелки Е7 не обладают ферментативными функциями. Этот класс вирусных белков является посредником в нарушении контроля клеточного роста, обрывая цепь физиологических сигналов клетки. Онкобелок Е7 связывается с белком ретинобластомы (белок RB), что приводит к выделению транскрипционного фактора E2F, который действует на промоторные элементы множества клеточных генов, экспрессия которых специфична для S-фазы клеточного деления. Экспрессия белка Е7 так же, как и белка Е6, играет ключевую роль в репликации ВПЧ. Так как активная репликация ВПЧ происходит в дифференцирующихся кератиноцитах, ВПЧ должен задерживать терминальную дифференцировку этих клеток и экспрессию генов, контролирующих клеточное деление. В это же время в результате координированной экспрессии и активности белков Е6 и Е7 происходит выраженная экспансия шиповатого слоя эпидермиса [5].
Недавно было установлено, что белок Е7 активно взаимодействует с транскрипционными факторами ТВР, TAF110 и АР-1 [5]. Очень важное наблюдение получено при исследовании влияния этого белка на клеточный ответ при действии ИФН-a₂. Белок Е7 подавляет индукцию генов, отвечающих активацией экспрессии под влиянием эндогенного ИФН. Это свидетельствует о существовании своеобразного механизма ускользания ВПЧ от ИФН в условиях развивающейся инфекции.
В последние годы предпринимаются попытки создания противовирусных препаратов, направленных на подавление функций онкобелка Е7. В качестве перспективной мишени рассматривается взаимодействие белка Е7 с белком ретинобластомы RB. Недавно рентгеноструктурным анализом расшифрована структура "кармана" белка RB, который заполняется при образовании комплекса с доменом белка Е7 ВПЧ типа 16 (Lee и соавт., 1998). Белок Е7 имеет относительно малые размеры и является моделью молекулярного дизайна противовирусных препаратов направленного действия.
Ранний белок Е2 – транскрипционный модулятор и кофактор репликации
Ранний белок Е2 представляет собой димерный протеин многофункционального характера. Он обладает способностью сайт-специфически связываться с ДНК ВПЧ в области 12-членного палиндромного мотива, характерного для всех папилломавирусов. Благодаря сайт-специфическому связыванию белок Е2 может проявлять функции как транскрипционного активатора, так и репрессора путем дополнительного взаимодействия с такими клеточными транскрипционными факторами, как SP1 и ТВР.
Кроме этого, белок Е2 необходим для репликации вирусной ДНК. Он как бы направляет хеликазу – белок Е1 к ориджину репликации (т.е. к точке инициации редупликации ДНК).
Более того, на кожной модели у кроликов достоверно установлено, что оба гена Е1 и Е2 необходимы для развития в местах инфицирования характерных эрозий [1].
Белок Е2 несет еще одну очень важную функцию в распространении вирусной инфекции. Именно он контролирует передачу эписомной (цитоплазматической) вирусной ДНК дочерним клеткам в процессе клеточного деления. Таким образом, белок Е2 обеспечивает контроль за персистенцией и распространением вирусной инфекции.
Методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) недавно полностью расшифрована пространственная структура белка Е2. Установлена локализация ДНК-связывающего домена и участков молекулы белка, ответственных за димеризацию. На основе этих данных проводятся исследования по целенаправленному дизайну противовирусных препаратов. Учитывая высокую консервативность белка Е2, можно рассчитывать на реальный успех этих исследований и разработку этиотропных препаратов широкого спектра действия в отношении всех типов ВПЧ [1, 5].
Этот класс соединений заслуживает отдельного рассмотрения.

Белок Е1 – вирусная хеликаза
Белок Е1 является ДНК-хеликазой – ферментом, ответственным за деспирализацию вирусной ДНК в сайте инициации репликации – ориджине репликации.
Возвращаясь к белку Е2, следует отметить, что он относится к белкам – "аксессуарам" репликации. В частности, белок Е2 связывается с белком Е1 и проксимальной частью домена ДНК-связывающего сайта посадки белка Е2. Он как бы "закрепляет" – стабилизирует белок Е1 на последовательности ориджина репликации.
Поведение белка Е1 на молекулярном уровне весьма необычно: при связывании с ДНК он образует гексомеры, т.е. ориджин репликации является инициатором его самосборки в надмолекулярный гексамерный комплекс.
Таким образом, белок Е1 имеет три весьма уязвимых свойства:
1. Каталитическую активность хеликазы, что позволяет использовать соответствующие ингибиторы.
2. Специфическое связывание с ДНК и комплексообразование с белком Е2 (два независимых домена).
3. Олигомеризацию – другой независимый домен.
В Институте гриппа РАМН разработаны ингибиторы, подавляющие связывание с ДНК и олигомеризацию Е1 белка, представляющие серьезную терапевтическую перспективу. В рамках международного проекта планируется создание лекарственных препаратов на основе этих веществ.
Phelps и соавт. считают, что исследования в этом направлении могут привести к созданию препаратов широкого спектра действия, включая ингибиторы хеликазы вируса гепатита C [1, 5].

Ранний белок Е4
Функция гена и белка Е4 остается пока неясной. Предполагается, что этот белок вовлечен в контроль репликации ДНК, в частности формирования ковалентно замкнутых форм ДНК, способных интегрироваться в зрелые вирусные частицы. Этот белок отличается значительной вариабельностью среди различных типов и подтипов ВПЧ.
Белок Е4 вызывает дезинтеграцию клеточного скелета. Проявление этой уникальной функции сопровождается также олигомеризацией. Предполагается, что взаимодействие с цитоскелетом высокоспецифично и ограничено только специфическим распознаванием кератиновых филаментов [1, 5].

Поздние белки H1 и Н2
Как уже указывалось, экспрессия поздних генов ВПЧ происходит только в дифференцированных кератиноцитах. Основной капсидный белок вируса папилломы H1, вероятно, несет функции распознавания клеточного рецептора, т.е. ответствен за инфицирование клеток базального слоя эпидермиса. Дальнейшая идентификация рецепторсвязывающего сайта должна привести к формулированию, стратегии конструирования лекарственных препаратов, направленных на ингибирование проникновения вируса в клетки эпидермиса.
Белок H1 достаточно консервативен, что позволяет рассчитывать на успешный выбор препаратов в отношении большинства типов ВПЧ и, естественно, создание вакцины.
Белки H1 и Н2 in vitro и при селективной экспрессии в клетках образуют безнуклеиновые вирусоподобные частицы, т.е. проявляют способность к самосборке.
За последние 2 года до клинических испытаний доведены рекомбинантные и пептидные вакцины. В частности, для лечебной и профилактической вакцинации испытываются вакцины типа ДНК-вакцин и рекомбинантная вакцина на основе вируса осповакцины. Эти проекты специально ориентированы на назофарингеальную патологию. Авторы проектов утверждают, что до 90% назофарингеальных опухолей (миндалин, мягкого неба, задней стенки носоглоток, основание языка) вызваны ВПЧ типа 16, что делает противовирусную вакцинацию достаточно обоснованной [1].

Современные представления о механизме канцерогенеза, обусловленного ВПЧ
Как уже упоминалось, ВПЧ инфицирует эпителиальные ткани, что подтверждается обнаружением эписомального вирусного генома в клетках базального слоя эпителия. Жизненный цикл вируса тесно связан с дифференцировкой клетки-хозяина. Репликация вирусной ДНК и синтез капсидных белков вируса происходят в наиболее дифференцированных слоях эпителия. Вирус обладает целым набором механизмов, подчиняющих своим интересам жизнедеятельность инфицированной клетки. ДНК вируса кодирует синтез двух белков Е6 и Е7, которые индуцируют переход дифференцированных клеток в S-фазу клеточного цикла. На стадии активной репродукции вируса экспрессия генов Е6 и Е7 регулируется продуктом гена Е2, являющимся репрессором транскрипции этих генов. Именно поэтому, пока вирус находится в эписомальном состоянии, наблюдаются доброкачественные процессы разрастания инфицированных тканей. Ключевым событием в малигнизации клеток является интеграция вируса в геном клеток, которая сопровождается делецией гена Е2 (рис. 2). Это событие имеет два важных последствия:
1. В эпителиальных клетках с интегрированной формой ВПЧ регистрируется сверхэкспрессия генов Е6 и Е7, так как в процессе интеграции утрачивается ген Е2, кодирующий репрессор транскрипции этих генов.
2. Любые противовирусные препараты бессильны остановить процесс опухолевой трансформации, так как инфицированные клетки не содержат вирус в традиционном понимании, и все лечебные мероприятия должны быть направлены на элиминацию клеток с интегрированной формой генома ВПЧ.
Контроль клеточного цикла и дифференцировка клеток осуществляются белками Е6 и Е7 посредством их взаимодействия и инактивации таких "ключевых" белков-регуляторов пролиферативной активности клеток, как p53 и белок ретинобластомы (pRB). Бесконтрольная пролиферация инфицированных клеток приводит к накоплению генетических повреждений и в конечном счете к малигнизации. Онкобелок Е7 использует несколько путей для регуляции клеточного цикла. Установлено, что Е7 способен образовывать стабильный комплекс с белком pRB, вызывая его деградацию, что приводит к высвобождению транскрипционного фактора E2F, который стимулирует транскрипцию генов, необходимых для репликации ДНК и S-фазы клеточного цикла. Е7 также влияет на активность целого ряда белков клеточного цикла, как А и Е циклины, cdk2 киназу и ингибиторы циклинзависимой киназы р21 и р27 II (рис. 3).

Роль клеточного белка p53 в этиологии рака РШМ
Белок Р53 локализуется в клеточном ядре, имеет молекулярную массу 53 кД и состоит из 393 аминокислот. Одним из наиболее значимых свойств белка, определяющих повышенный интерес к нему, является его способность контролировать пролиферативную активность клеток. В 1991 г. было обнаружено, что белок, выделенный из опухолевых клеток, отличается от своего нормального гомолога наличием мутаций [1]. Детальное исследование структурно-функциональных свойств белка позволило установить, что он является ингибитором клеточных протеинкиназ, осуществляя таким образом контроль над клеточным циклом. Мутантная форма белка утрачивает это свойство, вследствие чего возникает опухолевая трансформация. Тот факт, что все опухоли содержат мутантный вариант p53, позволил отнести этот белок, а именно его нормальный гомолог, к супрессорам опухолевого роста [1, 5]. Установлено, что онкобелок Е6, кодируемый вирусами ВПЧ-18 и ВПЧ-16, может взаимодействовать с белком р53, вызывая его деградацию. Исследование нуклеотидной последовательности гена, кодирующего р53, показало, что он имеет полиморфную структуру в положении 72. В человеческой популяции описано два аллеля, один из которых имеет в положении 72 аргинин, а другой – пролин. A.Storey и соавт. обнаружили, что аллель p53Arg разрушается белком Е6 ВПЧ-18 со значительно большей скоростью, чем аллель p53 Pro [1]. На основании этих данных авторы высказали предположение, что аллельное состояние гена p53 может способствовать возникновению РШМ, ассоциированного с папилломавирусной инфекцией. Для проверки этого предположения у 30 пациенток с диагнозом РШМ была исследована структура гена p53. В 76% случаев биопсийный материал из опухолей был гомозиготен по аллелю p53Arg, тогда как в контрольной группе этот показатель составлял 17% [1, 5].

Роль гормональных факторов в развитии РШМ
Хорошо известна роль эстрогенов в развитии неопластических процессов в так называемых эстроген-чувствительных тканях. К числу последних относятся ткани молочной железы, эндометрия и шейки матки, а также эпителия гортани. Эстрадиол – один из наиболее активных женских половых гормонов – обладает высоким сродством к эстрогеновым рецепторам и, взаимодействуя с ними, оказывает существенное влияние на метаболическую и пролиферативную активность клеток [1].
Ферментативная система цитохромов Р-450 обеспечивает конверсию эстрадиола в два основных метаболита: 16a-гидроксистерон (16a-ОН) и 2-гидроксистерон (2-ОН) (рис. 4).
Первый из них (16a-ОН) относится к категории "агрессивных гормонов", вызывающих длительный эффект, приводящий к нежелательным последствиям. Имеются данные, что 16a-ОН способен образовывать ковалентные связи с рецептором, т.е. необратимо взаимодействовать с ним. Второй метаболит (2-ОН), обладая умеренными функциями, нормализует клеточный рост. Давно было отмечено, что тканевые изменения в цервикальном канале, вызванные ВПЧ, локализованы главным образом в эстроген-чувствительных зонах. Более того, было установлено, что там, где наблюдается активная экспрессия белков ВПЧ, отмечен высокий уровень синтеза метаболита 16a-ОН, сравнимый с таковым в раковых клетках молочной железы. Следует подчеркнуть, что в норме эпителиальные клетки шейки матки не способны обеспечивать превращение эстрадиола в 16a-гидроксистерон. Таким образом, активная репродукция ВПЧ индуцирует образование агрессивного метаболита в инфицированных клетках [1].
Инфицированные кератиноциты человека проявляют пролиферативную активность in vitro, но при этом не имеют опухолевого фенотипа при микроскопическом исследовании. Добавление в культуральную среду экзогенного 16a-ОН превращает клетки в типично раковые [1]. На основании этих данных сделан вывод о том, что инфицирование эпителиальных клеток ВПЧ является необходимым, но недостаточным фактором для малигнизации. Для формирования необратимой неоплазии необходимо:
1) активная экспрессия генов Е6 и Е7 вируса,
2) индукция метаболических механизмов конверсии эстрадиола в 16a-ОН,
3) индукция множественных повреждений хромосомной ДНК в инфицированной клетке, которая завершает процесс перерождения.
Ключевая роль 16a-ОН-стерона в раковом перерождении клеток, инфицированных ВПЧ (см. таблицу и рис. 5), подтверждается исследованиями клеток эпителия шейки в норме и при цервикальной карциноме.

Рис. 1. Физическая карта генома ВПЧ-11. На физической карте генома ВПЧ видно, что 8 открытых рамок считывания кодируют 6 ранних белков и 2 поздних. Наиболее важными с точки зрения онкогенных потенций ВПЧ являются онкобелки Е5, Е6 и Е7. Белок Е4 взаимодействует с цитоскелетом эпителиальных клеток, что приводит к дезинтеграции клеточного скелета. Белки Е1 и Е2 представляют собой хеликазу и транскрипционный модулятор соответственно. Поздние белки H1 и Н2 относятся к капсидным белкам. В частности, H1 является основным капсидным белком, а белок Н2 – минорным капсидным белком с ДНК-связывающими функциями. См. подробности в тексте и [5].