Тема Тс7. Фактори, що впливають на біосинтез у процесі культивування

На метаболізм продуцентів впливають умови зовнішнього середовища, рівень поживних речовин, їхня збалансованість, відвід метаболітів, зміна активної кислотності середовища, температури, насиченість середовища розчиненим киснем, стан і вік культури продуцента та багато інших факторів. Залежно від способу культивування і фізіологічних особливостей продуцента значимість цих факторів і ступінь їх впливу на процес біосинтезу різні, однак деякі загальні закономірності можна виділити.

Вологість поживного середовища при поверхневому культивуванні. Вологість середовища при вирощуванні продуцента на твердих сипучих середовищах має велике значення, тому що при вологості середовища від 11 до 20% розвиток мікроорганізмів майже неможливий.

Невеликий ріст починається при вологості понад 30 %. Вологість 40 – 45 % уважається несприятливою й сприяє рясному спороутворенню культури. Ця обставина використається при одержанні спороносної культури як посівний матеріал для поверхневої культивації продуцентів ферментів. При вологості середовища 53—68 % спостерігається найбільше накопичення ферментів. Оптимальна вологість залежить багато в чому від продуцента, але в основному від фізичного стану середовища за даної вологості. Спостережуваний при вологості понад 60-68 % спад біосинтезу порозумівається погіршенням проникності середовища для повітря. Висока вологість сприяє злипанню часток середовища, порушенню пухкої структури й погіршенню умов росту культури й біосинтезу ферментів.

При поверхневому культивуванні з ростом культури відбувається помітне зменшення вмісту сухих речовин, які перетворюються в СО₂ н Н₂О. Тому якщо культивування ведеться в закритих ємностях (наприклад, у колбах під ватними пробками, матрацах чи у закритих спеціалізованих кюветах), де випарювання вологи обмежене, то в міру росту культури спостерігається деяке збільшення вологості. Але якщо культура вирощується у відкритих ємностях при інтенсивній аерації, то спостерігається її підсушування, що при W<50 % може викликати зменшення продуктивності культури й зниження активності в готовому продукті.

Оптимальна вологість й її рівень при культивуванні багато в чому залежать від фізіологічних особливостей продуцента, складу середовища і її сипкості, і в кожному конкретному випадку визначаються експериментально.

Аерація зростаючої культури. Ступінь аерації багато в чому визначається способом культивування й фізіологією мікроорганізмів - продуцентів біологічно-активних речовин. Аерація зростаючої культури переслідує три мети: постачання мікроорганізму необхідною для росту й розвитку кількістю кисню; видалення з повітрям, що відходить, газоподібних продуктів обміну; часткове зняття й відвід виділюваного мікроорганізмом у процесі росту фізіологічного тепла.

При поверхневому культивуванні найбільше значення надається питанню відводу повітрям тепла. У зв'язку із цим необхідно розглянути фази росту мікроскопічних грибів, тому що саме ця група мікроорганізмів в основному використається при поверхневому способі культивування.

Перша фаза — це набрякання конідій (спор) і їхнє проростання, її тривалість 10—12 год. Ця стадія не супроводжується помітним тепловиділенням, і тому аерація культури помірна (4—5 об’ємів повітря на об’єм камери в годину) при відносній вологості повітря 95-96 % й оптимальній температурі. Зовнішніх змін живильного на середовища цій стадії не відбувається.

Як тільки на поверхні середовища з'являється ледве помітний пушок, це значить, що починається друга фаза (тропофаза) - стадія активного росту міцелію. Вона звичайно триває 12- 40 год і супроводжується інтенсивним споживанням живильних речовин із середовища, виділенням тепла, вуглекислоти й води. Міцелій гриба пронизує всю товщу поживного середовища, утворюючи зрослу пористу масу білуватого кольору. Саме в цей час мікроорганізм має потребу в інтенсивній аерації для видалення газоподібних продуктів метаболізму, постачання киснем і відводу тепла, що виділяється. У цей період температурний режим у камері варто дотримувати особливо строго й підтримувати відносну вологість повітря близькою до 100%, інакше можна передчасно підсушити культуру, і нагромадження ферментів у культурі призупиниться. Важливо відзначити, що чим інтенсивніша аерація, тим глибше йдуть окисні процеси, більше споживається сухої речовини середовища на дихання і тем менше вихід готової культури. Процес інтенсивного окислювання органічних речовин середовища супроводжується виділенням великої кількості тепла - до 3000-4000 кДж на 1 кг готової культури, що становить 75-80 % усього виділюваного тепла, при цьому споживається до 25-30 % сухої речовини. Для розрахунку необхідного повітрообміну звичайно будують графік тепловиділення за весь період вирощування мікроорганізму, тому що залежно від складу середовища й виду мікроорганізму криві тепловиділення будуть різні (рис. 7.1). Так, при культивуванні мікроорганізмів на пшеничній дерті, що містять 16-25% крохмалю, питоме тепловиділення досягає 340-375 кДж/(кг∙год), а на середовищі, що складається переважно з лушпайки круп'яних культур, які містять в 3 рази менше крохмалю,питоме тепловиділення близько 125 кДж/ /(кг∙год).

Продуктивність аераційних установок визначається по другій стадії росту культури. Звичайно на цій стадії кратність повітрообміну становить 30—60 м³/(м³∙год) при відносній вологості 100%. Повітря, що подається в камеру на другій стадії росту культури, має температуру на 2—3°С нижче, ніж на першій. Це пов'язане з тим, що повітря, проходячи над зростаючою культурою, нагрівається на 2—3°С, так як культура мікроорганізму в цей період помітно (на 4—5°С) розігрівається. Вологоємність повітря, що відходить, підвищується, і він несе частину вологи з культури. Відбувається підсихання культури, особливо її верхнього шару. Без шкоди для якості готової культури при аерації може бути вилучено до 0,5 кг вологи на 1 кг культури.

1 – A. oryzae 8F; 2 – A. awamori 16,

3 – Trichothecium roseum

Рисунок 7.1 - Питоме тепловиділення в процесі поверхневого культивування

Середня фізіологічна потреба в кисні у фазі активного росту становить близько 7,6 м³ на 1 т культури в годину, або в перерахуванні на повітря за умови повного споживання з нього кисню — близько 36,5 м³ на 1 т культури в годину. Загальна потреба в повітрі, необхідна для нормального розвитку грибів, становить у середньому 600—650 м³ на 1 т культури за весь цикл росту.

Третя фаза (ідіофаза) відповідає біохімічній і морфологічній спеціалізації культури, коли спостерігаються конідієутворення й нагромадження вторинних метаболітів. Це період інтенсивного утворення мікроорганізмами позаклітинних ферментів. На цій стадії ріст гриба трохи пригальмовується, гриб досягає фізіологічної зрілості. Для більшості мікроскопічних грибів на цій стадії розвитку рекомендується знизити температуру в ростильних камерах на 3—4°С и зменшити повітрообмін в 3—5 разів у порівнянні з періодом інтенсивного зростання. Коли нагромадження ферментів у культурі досягає максимуму, у камеру подають сухе, підігріте до 38—40°С повітря. Культура за 2-3 год підсихає на 10-15%, що полегшує її наступну обробку й відділення від перфорованої поверхні кювет.

Витрата повітря при поверхневому способі культивування для охолодження приблизно в 90-100 разів перевищує фізіологічну потребу в ньому мікроорганізмів, тому процес підведення О₂ до культури й відводу вуглекислоти не є лімітуючим.

При глибинному вирощуванні аерація також дуже важлива, оскільки основна кількість продуцентів являються аеробами. Аналіз даних показує, що аерація глибинної культури є важливим чинником і його інтенсивність по-різному впливає на продуктивність різних мікроорганізмів. Навіть один й той же мікроорганізм при різному ступені аерації неоднаково накопичує окремі ферменти. У цілому ж збільшення ступеня аерації середовища приводить, як правило, до інтенсифікації процесу біосинтезу ферментів й у більшості випадків до скорочення тривалості культивування.

У цей час питанням аерації й перемішування у ферментній промисловості приділяється велика увага, тому що в них закладені сховані резерви інтенсифікації виробництва біологічно-активних речовин при глибинному культивуванні мікроорганізмів. Кількість повітря, що витрачається на аерацію, визначається ступенем розчинення кисню в середовищі, що залежить від в'язкості середовища й конструктивних особливостей ферментатора й тому в кожному випадку вимагає експериментального вивчення й уточнення.

Тривалість культивування. Швидкість росту окремих штамів неоднакова. Оптимальна тривалість культивування, що забезпечує максимальну продуктивність, установлюється експериментально. Вона залежить від дуже багатьох факторів: складу середовища й способу її подачі при культивуванні, ступеня аерації середовища, від того, чи є біологічно-активна речовина позаклітинним або внутрішньоклітинним продуктом, від роду продуцента і ін. У деяких випадках додаткове введення середовища (підживлення) у початковій стадії росту дозволяє на 30-40 % скоротити тривалість культивування й значно підвищити продуктивність мікроорганізмів. Тривалість культивування найчастіше залежить від фізіологічних особливостей обраного продуцента. Тому прогнозувати оптимальну тривалість вирощування дуже складно й потрібно її експериментальне визначення.

Величина рН середовища. При поверхневому культивуванні рН середовища менше впливає на метаболізм, тому що в силу високої буферності й малої вологості середовища він майже не змінюється. При глибинному культивуванні рН середовища має вирішальне значення, воно сильно змінюється при стерилізації середовищ і особливо в процесі культивування.

При поверхневому культивуванні для зволоження твердого середовища використається водопровідна вода, рН зволоженого середовища в цьому випадку становить 5,0-5,6. Досить часто дерть воложать слабкими розчинами соляної, сіркової або молочною кислотою, тоді рН зволоженого середовища дорівнює 4,5-5,0. Додавання кислот сприяє створенню селективних умов для розвитку продуцентів, що дозволяє знизити вимоги до стерилізації середовища й повітря.

Вплив рН середовища при глибинному культивуванні мікроорганізмів величезне, причому велике значення має не тільки його вихідна величина, але й зміна його при стерилізації й у результаті споживання катіонів або аніонів середовища в процесі життєдіяльності мікроорганізмів. У результаті такого споживання відбувається або підлужування, або підкислення культуральної рідини.

Оптимальне вихідне значення рН середовища залежить від особливостей продуцента, але можна виділити загальні закономірності. Гриби й дріжджеподібні організми добре ростуть в середовищах із рН від 3,8 до 5,6. Бактерії найкраще розвиваються при рН, близькому до нейтрального (6,2-7,4). Залежно від складу середовища і продуктів метаболізму рН середовища може зрушуватися як у кислу, так й у лужну зону.

Температура культивації. Більшість мікроорганізмів-продуцентів являються мезофілами, оптимальна температура для їх розвитку – 22-32ºC. Серед бактеріальних продуцентів часто зустрічаються термофільні мікроорганізми, для яких оптимальна температура культивування становить 35—55 ºС.

Термофільні мікроорганізми становлять особливий інтерес для промислового використання, тому що культивування при високих температурах створює селективні умови для їхнього розвитку й дозволяє знизити вимоги до стерильності процесу. Крім того, термофільні мікроорганізми синтезують ферменти, що володіють підвищеною термостійкістю.

Контрольні питання до теми Тс7

1. Як залежить метаболічна активність мікроорганізмів від впливу факторів оточуючого середовища?

2. Застосування основних закономірностей регуляції метаболізму у мікроорганізмів для підвищення їх продуктивності.